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某规模化猪场主要细菌性疫病感染的诊断

2016-08-15 09:01 字体:   打印 收藏 

摘要:为了确诊规模化猪场主要细菌性疫病的感染状况,本实验通过对贵州省10家规模化猪场送检的200血液样品及部分病料进行了副猪嗜血杆菌、猪传染性胸膜肺炎杆菌、猪链球菌、猪丹毒、猪大肠杆菌、猪巴氏杆菌、猪沙门氏菌、猪葡萄球菌等常见的细菌进行了分离培养。结果表明:10个规模化猪场的副猪嗜血杆菌、猪传染性胸膜肺炎杆菌、猪链球菌、猪丹毒杆菌、猪大肠杆菌、猪巴氏杆菌、猪沙门氏菌、猪葡萄球菌的阳性率分别20.5%、12.5%、10.5%、8.5%、13.5%、15.5%、7.5%和3.5%。其中,副猪嗜血杆菌、猪传染性胸膜肺炎杆菌、猪链球菌、猪大肠杆菌和猪巴氏杆菌几种细菌的感染率均超过10%。综合分析表明,贵州省某10家细菌性疫病的已成地方性流行,这对规模化猪场的养殖业的发展带来很大影响。
关键词:规模化猪场;细菌性疫病;感染状况;诊断
 
为了确诊贵州省10家规模化猪场送检的200血液样品及部分病料进行了猪丹毒、猪链球菌、副猪嗜血杆菌、大肠杆菌、巴氏杆菌、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌等常见的细菌的感染状况。本实验通过对细菌初步培养,然后进行纯化鉴定,分离出8种细菌,其中,副猪嗜血杆菌、猪传染性胸膜肺炎杆菌、猪链球菌、猪大肠杆菌和猪巴氏杆菌感染较为突出。现将研究结果报道如下:
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样本  采集贵州省某规模化猪场的血清(前腔静脉无菌采血)200份、疑似病例的经产母猪、仔猪和育肥猪的血液、肺脏、心脏、肾脏、脾脏和粪便等。
1.1.2 主要试剂及仪器  胰蛋白大豆琼脂(TSA)和胰蛋白大豆肉汤(TSB)购自美国Becton Dickinsonand公司;烟酰胺腺嘌呤二核普酸(NAD)购自中国医药(集团)上海化学试剂公司;犊牛血清购自杭州四季青公司;麦康凯培养基、三糖铁培养基和生化鉴定管购自杭州天和微生物试剂公司;CO2培养箱购自Backman公司;生物显微镜购自Olympus公司;分型所用标准血清为本实验室制备和保存。革兰氏染液购自上海生物工程有限公司。
1.2 方法
1.2.1 血清的制备
将采集到的血液样品于37℃放置1h,再置于4℃冰箱中2~3h,4000 rpm室温离心5 min,收集上清液于新离心管中并做好标记。
1.2.2 培养基的制备
将TSA和TSB按一定比例充分溶解在三蒸水里,调pH至7.0,高压灭菌,然后倾倒平皿中,冷却凝固后封装4℃保存备用。麦康凯培养基、三糖铁培养基同样方法制备。
1.3 细菌的初步分离
在超净台中,对血液、内脏等样本进行表面清洗消毒,严格按照无菌操作各取一部分小块组织,将所取的组织均匀涂抹在血清平板和麦康凯培养基上,分区划线,置培养箱中,37℃培养24h~72 h。
1.4 细菌的纯化鉴定
将培养好的细菌,用接种环挑取少许菌落,分别进行镜检、涂片、染色对其进行细菌的形态特性观察分析,并对菌落进行传代培养,获取较纯的菌株,对纯化后的细菌进行一系列的生化鉴定和其他相关检测试验。
1.4.1 副猪嗜血杆菌的诊断和鉴定
临床诊断送检病理中疑似的病死猪,剖检猪组织,观察其病理组织变化。
通过革兰氏染色法染色,并用显微镜观察副猪嗜血杆菌形态和染色后呈现的颜色。同时,进行与金黄色葡萄球菌划线培养24h。
1.4.2 猪传染性胸膜肺炎杆菌的诊断和鉴定
剖检疑似猪传染性胸膜肺炎的仔猪组织,观察其病理组织变化。
通过革兰氏染色法染色,用显微镜观察其形态特征,并观察其呈现的颜色。通过普通培养基和麦康凯培养基进行培养特性观察,同时进行VP和MP 试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)进行血清学试验。
1.4.3 猪链球菌的诊断和鉴定
临床诊断疑似猪链球菌感染的病猪,剖检疑似猪链球菌症状的育肥猪组织病理变化。
取病死猪脾脏做触片镜检,经革兰氏染色,观察其形态特征和呈现的颜色,并用血琼脂平板和肉汤培养基进行37℃培养24h。同时进行接种2只小鼠实验,接种量为0.3mL/只,另设健康小鼠2只注射生理盐水作对照。
1.4.4 猪丹毒杆菌的诊断和鉴定
临床检查疑似猪丹毒杆菌感染的病猪,剖检诊断病理变化特征。
取肺脏组织进行涂片,染色,镜检观察,并用血琼脂培养基37℃培养24h,然后挑取菌落再接种到马丁肉汤琼脂培养基进行培养和生化鉴定分析。同时进行接种2只小鼠实验。
1.4.5 猪大肠杆菌的诊断和鉴定
临床检查疑似猪大肠杆菌感染的病猪,病理剖检诊断仔猪病理组织变化。
病猪急宰解剖,无菌采取心肌、心血、心包积液、肝、脾、淋巴结,涂片,瑞氏染色和革兰氏染色镜检,肉汤培养基37℃培养24h。
1.4.6 巴氏杆菌的诊断和鉴定
临床检查疑似猪巴氏杆菌感染的病猪,病理剖检诊断仔猪病理组织变化。
挑取初步培养的巴氏杆菌单个菌落进行革兰氏染色,镜检观察其形态特征,然后挑取单个菌落接种于鲜血琼脂板、麦康凯琼脂板和普通肉汤培养。37℃培养24h观察结果。
1.4.7 沙门氏菌的诊断和鉴定
送检猪只病料样本中进行临床诊断,对病死猪进行剖检诊断,观察临床症状和病理变化。
无菌取死猪的肺,肝,脾病料接种于普通琼脂培养基,鲜血琼脂培养基,37℃培养24h。然后挑取单个菌落,进行革兰氏染色,镜检观察细菌形态。
1.4.8 葡萄球菌的诊断和鉴定
对疑似的几只仔猪进行临床诊断,并剖检其病理变化,观察其临床症状和病理变化。
无菌取病死猪痴皮下分泌物、心脏和脾脏涂片,革兰氏染色镜检。取痴皮下分泌物、心脏和脾脏接种于普通营养琼脂和鲜血琼脂平板培养基,37℃培养24h观察结果。
2 结果
2.1 副猪嗜血杆菌检测结果
通过对10家规模化猪场200份病料收集处理,经过剖检诊断剖检病变组织主要表现为纤维素性浆膜炎,可见胸腔内有大量的犹如豆腐渣样纤维素渗出物并覆盖于肺脏、心脏及肋胸膜表面,也有心脏、肺脏及肋胸膜的粘连;心包液增多、浑浊;全身淋巴结不同程度肿大,呈灰白色,切面湿润,有大量浆液流出(如图1)。细菌分离鉴定后细菌多呈短杆状,革兰氏呈阴性(如图2)。一共有151份患有副猪嗜血杆菌病例,阳性率为20.5%(表1)。与金黄色葡萄球菌划线培养24h后,有典型的“卫星生长现象”,并且副猪嗜血杆菌菌落周围不溶血。表明该病在贵州省规模化猪场的细菌方面感染已相当普遍。
 
表1  10家规模化猪场200份病料副猪嗜血杆菌检测结果

  经产母猪 仔猪 育肥猪 总计
检测份数 62 87 51 200
阳性份数 10 22 9 41
阳性率/% 16.1 25.3 17.6 20.5
2.2 猪传染性胸膜肺炎杆菌检测结果
通过对200份样本进行猪传染性胸膜肺炎杆菌的检测,分别进行剖检诊断,表现为肺肿大,水肿苍白,肺炎多为两侧性,尖叶、心叶多出现暗红色的肝变,质地坚实,切面易碎,肺表面有一层白色纤维素性薄膜,当伴发支原体时颜色稍黄,多见于胸膜粘连区。较慢性病例,肺膈叶上有大小不一的脓肿样结节,肺门淋巴结有暗红色出血区,气管及支气管充满粉红色泡沫,鼻孔流出带血丝的分泌液,有时心包膜与心肌外膜发生粘连(如图3)、细菌分离镜检(如图4)和血清学检测显示(表2),一共检测出25份阳性样本。通过猪传染性胸膜肺炎ELISA检测时间盒检测结果平均阳性率为12.5%(表1)。通过普通培养基和麦康凯培养基进行培养不生长,VP和MP试验为阴性。革兰氏染色红色,呈阴性。表明该病在贵州省规模化猪场的细菌方面感染较为常见。
 
表2  10家规模化猪场200份血清猪传染性胸膜肺炎ELISA检测结果(OD630

  经产母猪 仔猪 育肥猪 总计
检测份数 62 87 51 200
阳性份数 8 11 6 25
阳性率/% 12.9 12.6 11.8 12.5
2.3 猪链球菌的检测结果
经过剖检诊断和实验室诊断,分离培养出的细菌中有大量的猪链球菌感染,临床诊断可见,肝脏体积明显增大,变紫,表面严重淤血并伴有出血点(如图5)。镜检可见4~8个菌落排列的链球菌,革兰氏染色蓝紫色,呈阳性(如图6)。鲜血琼脂板培养生长良好,肉汤培养可见管底形成絮状沉淀,上液澄清。接种小鼠4~6d,对照小鼠健康存活,而接种小鼠相继死亡。从小鼠的肝脏,心脏中可分离出链球菌。表明该均对小鼠具有致病性。从200份样本中,检测总阳性率为10.5%(表3)。

表3  10家规模化猪场200份病料猪链球菌检测结果

  经产母猪 仔猪 育肥猪 总计
检测份数 62 87 51 200
阳性份数 15 4 2 21
阳性率/% 24.2 4.6 3.9 10.5
2.4 猪丹毒的检测结果
在200份样本中临床诊断出有疑似猪丹毒病一共有15头,表现为皮肤表面出现疹块。剖检肺部充血水肿,肾脏肿大(如图7),发现体温达到42~43℃,稽留不退,体弱,不愿走动,躺卧地上,不食,有时呕叶、结膜膜充血,粪便干硬呈栗状,附有粘液、有抽搐现象。皮肤表面出现疹块。剖检肺部充血水肿,肾脏肿大。经过镜检和生化培养鉴定发现,一共有17头感染猪丹毒,其中包括经产母猪10头,仔猪5头,育肥猪2头。镜检可见平直或微弯细小杆菌,多数呈长丝状(如图8)。革兰氏染色为蓝紫色,呈阳性。感染动物实验中,接种小鼠7d后相继死亡,而对照组小鼠健康存活。此次猪丹毒检测阳性率在8.5%(表4)。

表4  10家规模化猪场200份病料猪丹毒检测结果

  经产母猪 仔猪 育肥猪 总计
检测份数 62 87 51 200
阳性份数 10 5 2 17
阳性率/% 16.1 5.4 3.9 8.5
2.5 猪大肠杆菌的检测结果
经剖检诊断结果显示,肠系膜淋巴结肿大,胃粘膜、肠系膜水肿明显,切开有黄色液体渗出(如图9),颌下淋巴结、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴结均明显肿大、出血,色泽暗红,肺表面呈褐红色,切面呈灰黄色,质地变实,心包有少量积液,肝、脾、肾均有针尖大出血点,胃粘膜、肠系膜水肿明显,切开有黄色液体渗出。经涂片,革兰氏染色镜检,可看到呈单个或成双排列,无荚膜的革兰氏阴性杆菌(如图10)。通过纯化培养200份样本中,有27份样本有大肠杆菌感染,阳性率为13.5%(表5)。

 
 
 
 
 
表5  10家规模化猪场200份病料猪大肠杆菌检测结果

  经产母猪 仔猪 育肥猪 总计
检测份数 62 87 51 200
阳性份数 5 10 12 27
阳性率/% 8.1 11.5 23.5 13.5
2.6 猪巴氏杆菌的检测结果
剖检诊断疑似猪巴氏杆菌的病例,可见剖检肺部有出血斑点、气肿和红色肝变(如图11),  病死猪皮肤有红斑,死亡时嘴张开,显示为呼吸抑制或室息死亡,剖检肺部有出血斑点、气肿和红色肝变,心衰,心包和胸腔积液,气管内有大量泡沫性分泌物,部分猪胸膜上有纤维素性附着物甚至胸膜与肺粘连。镜检可见红色球杆状细菌,有荚膜(如图12)。通过在血清琼脂板上培养后再进行纯培养可见短杆状菌,无芽孢,单个或成对存在,符合巴氏杆菌的特征。对送检的每份样本进行检测结果31份有巴氏杆菌感染,其阳性率为15.6%(表6)。
 
表6  10家规模化猪场200份病料猪巴氏杆菌检测结果

  经产母猪 仔猪 育肥猪 总计
检测份数 62 87 51 200
阳性份数 8 6 17 31
阳性率/% 12.9 6.9 33.3 15.5
2.7 猪沙门氏菌的检测结果
剖检诊断送检疑似猪沙门氏菌感染的病料,临床症状主要表现为肝脏表面有多量针尖大至粟粒大的灰黄色的坏死灶,脾脏显著肿大,色暗带蓝,触压时感觉绵软,类似橡皮,被膜偶见散在的点状出血,切面呈蓝红色,脾白髓周围有红晕环绕,可以看到肿大的淋巴滤泡(如图13)。镜检观察可见革兰氏染色红色,呈阴性,单个或多个杆状细菌排列(如图14)。在送检的200份样本中,检测出有15份样本有沙门氏菌感染,其阳性率在7.5%(表7)。
 
表7  10家规模化猪场200份病料猪沙门氏菌检测结果

  经产母猪 仔猪 育肥猪 总计
检测份数 62 87 51 200
阳性份数 1 9 5 15
阳性率/% 1.6 10.3 9.8 7.5
2.8 猪葡萄球菌的检测结果
通过临床诊断几只患有疑似葡萄球菌感染的仔猪,其主要症状为皮肤形成黑色痴皮,肥厚干裂,痴皮剥离后露出桃红色的真皮组织(如图15)。剖检诊断结果显示,体表淋巴结肿大,肝、脾、心脏等表面有大小不等的脓性坏死灶,肠道空虚,输尿管扩张,肾盂及输尿管聚集粘液样尿液。镜检涂片可见革兰氏染色阳性,有多量单个球形或成对葡萄状排列(如图16)。鲜血琼脂培养基37℃培养24h可见培养基上有白色、表面光滑、不透明的圆形菌落。送检样本检测出7份有葡萄球菌感染,阳性率在3.5%(表8)。

表8  10家规模化猪场200份病料猪葡萄球菌测结果

  经产母猪 仔猪 育肥猪 总计
检测份数 62 87 51 200
阳性份数 1 5 1 7
阳性率/% 1.6 5.7 1.9 3.5
3 讨论
近年来,随着规模化猪场不断发展,现代的猪场已逐渐趋于集约化,规模不断的扩大,在规划和管理的过程中,猪的疫病特别是细菌性疫病的发生也在不断扩大,发生率和死亡率均在上升[1],这给养猪业的发展带来巨大危害,控制和消灭规模化猪场的常见细菌性疾病,成为当前能否给养猪业的发展带来经济成本的关键[2]。规模化猪场主要常见的细菌性疫病有副猪嗜血杆菌、猪传染性胸膜肺炎杆菌、猪链球菌、猪丹毒杆菌、大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌等,这些细菌有单一感染,也有几种细菌混合感染,甚至与病毒性疫病相互混合感染,一般混合感染较为多发[3]。几种细菌混合感染较为普遍,通常是由一种细菌感染时,由于猪的机体免疫功能下降,周围的环境污染严重,饲料变质等原因而导致其他细菌乘虚而入,如布鲁斯杆菌、李氏杆菌引发二次感染,即导致继发感染,使猪发病情况继续恶化,一时导致疾病难以控制,造成高发病率、高死亡率[4]。另外,各种细菌还可以与多种病毒性疫病如猪繁殖与呼吸综合征病毒[5]、猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪附红细胞体病毒发生相互混合感染[6]。特别是几种细菌性疾病混合感染,因其细菌的生化特性和生长习性不同,在治疗和防治过程中增加了难度,给规模化猪场在疾病防控上带来巨大的困难[7]
从检查结果表明,副猪嗜血杆菌在贵州省发生较为普遍,在一年四季中均可发生,无明显的季节性,特别是贵州省地方气候,一年四季气候较为温和,差异不大,而且潮湿季节多发,很利于像副猪嗜血杆菌与链球菌等这样的细菌进行大量繁殖,感染周围的动物及人类,这就导致规模化猪场呈地方性流行[8]。当前的养殖环境中,贵州省大多数中小养殖户对疫病控制观念较为传统,没有建立较为完善的防控体系,不注重饲养管理方法,因此,常常因单一的副猪嗜血杆菌感染后与一些其他细菌如猪传染性胸膜肺炎杆菌、巴氏杆菌、附红细胞体等形成多重混合感染。另外,因动物机体免疫功能下降,通常会给病毒性疫病如猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环2型病毒和猪瘟病毒等相互混合感染而导致继发病[9]
通过本次实验室对贵州省10家规模化猪场主要细菌性疫病的流行状况进行研究显示,其中副猪嗜血杆菌病、猪传染性胸膜肺炎、猪链球菌、猪大肠杆菌和猪巴氏杆菌几种细菌的感染率均超过10%,呈广泛性传播和流行。另外,从病料样本中可检测出猪丹毒杆菌,其阳性率可达8.5%,猪丹毒病的感染也较为普遍。而猪沙门氏菌和葡萄球菌感染率分别为在7.5%和3.5%,感染率不高,一般规模化猪场可以有效地控制该病的发生。通过本次对200份样本进行细菌方法的检测表明,一种样本中可同时检测出多种细菌混合感染,同时,本实验还进行病毒性疫病的检测,200份样本中可检测出35份带有猪繁殖与呼吸综合征病毒的感染,阳性率达17.5%,这进一步说明常因一种疾病的原发感染和其他疫病混合感染而导致继发病。对于贵州省呈地方性流行的细菌感染,要想得到有效的控制该病的发生,必须要经常对猪群抗体定期监测和评估,选择合适的疫苗进行合理免疫,以增强保护力[10]。同时猪场应注意改善环境条件,加强饲养管理,减少应激因素,一旦发病,需要尽快检测出感染原发性感染和继发性感染疫病的种类,尽快筛选合理的敏感药物进行治疗,使猪群在发表期间得到有效控制。
参考文章:
[1] 白文彬,于康震.动物传染病诊断学[M].北京:中国农业出版社,2002,476-483.
[2] Rosendal S, Mitchell W R. Epidemiology of Haemophilus pleuropneumoniae infection in swines: A Survey of Ontario Pork Producers, 1981[J]. Can J comp Med, 1983, 471.
[3] 郭龙,汤细彪,尚书,等.2010年猪群常见细菌性疫病的分离鉴定与流行病学分析[A].第十二届全国规模化猪场主要疫病监控与净化专题研讨会2011,84-89.
[4] 刘建,马萍,汤德元,等.致褚流产的细菌性班病、寄生曳病及衣原体病诊断技术研究[J].中国动物保健,2012,14(3):4-8.
[5] 刘建,汤德元,曾智勇,等.猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪副嗜血杆菌混合感染的诊断[J].贵州农业科学,2012,40(9):167-169.
[6] 杜琼.副猪嗜血杆菌病的诊断与防治方法[J].兽医导刊,2009,(3):23-24.
[7] 郭志刚,方维新,张维平,等.红河州猪场主要传染病的血清流行病学调查[J].今日畜牧兽医,2011,(12):31-33.
[8] 陈宏远,张小雷,石明华.贵州省猪链球菌的分离鉴定[J].黑龙江畜牧兽医,2002,(10):37-39.  
[9] 曹广芝,赵波涛,赵鸿璋.规模化猪场疫病流行的现状分析及防控策略[J].今日养猪业,2008,(2):32-33.
[10] 吴聪明,汪洋.动物源细菌耐药性监测与流行病学研究[J].中国兽医杂志,2010,44(1):23-25.




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