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牛初乳的sIgA的制备方法

2015-11-07 16:19 字体:   打印 收藏 

1.分别在五头奶牛产后第一天和第十天取奶牛分泌物。把所取物用0.1M醋酸混匀,不断搅拌,直到pH到4.2.
 
2.用离心机去除沉淀下来的酪蛋白(12000g,4摄氏度,20分钟),离心后酪蛋白会浮在液体表面乘油脂状,去除它。
 
3. 往剩下的乳清里加入27g/100ml硫酸铵溶液,不停搅拌混匀。
 
4. 把液体拿去离心,12000g,10分钟,4摄氏度,然后球蛋白就会被沉淀。
 
5. 把球蛋白溶解在50:1体积的蒸馏水里面,24小时。溶解过后再次离心,12000g,10分钟,4摄氏度,弃除沉淀物。
 
6. 离心过后的上清(为乳清)为偏黄乳白色。
 
 
蛋白的估算
 
1. 用紫外线分光光度法,280纳米,系数E(1cm),结果等于13.7。
 
 
色谱层析法
 
1. 用色谱层析法来分析乳清样本。把两个样本串联在一起,90厘米高,5厘米直径,用Sephacryl S3000(药物用的化学品,Dorval,Quebec)把它们包起来。同时把这些样本与0.1M的tris-HCL(pH为7.0,)、10mM的EDTA、和1M的NaCl(tris缓冲剂)混合起来。
 
2. 再用色谱层析法分析被提取/消化出来的IgA/IgG1免疫球蛋白,同样把两个样本串连在一起,90cm高,2.5cm直径,用tris缓冲剂来平衡。
 
3. 在上面两个步骤中,使用漩涡振荡气泵收集15毫升的effluent fractions,注意色谱柱液体的流动方向应与地心引力相反。
 
 
胶的散透
 
1.与之前提到过的一样,此次也使用双重胶散透这步骤,不过这次有一点小小的改动。此次使用小白鼠的抗血清和已准备好的奶牛的免疫球蛋白重链(IgM, IgA, IgG1, and IgG2)来测试初乳血清样本、色谱层、和被消化的物质。
 
2.用0.15M的氯化钠过夜清洗所有拨片,晾干,再用酸化酒精库玛西蓝RB250染色。与之前提过的相同,此次也做免疫电泳。
 
 
碘-125 标记法/蛋白合并法
 
1.使用氯胺-T方法,每ug蛋白使用0.5mCi,与没有隐性基因的碘-125一起,来放射标记蛋白。
 
2.透析蛋白,弃除纯碘,留下0.15M的氯化钠。
 
3.运用压力透析法(Amicon XM 50膜),浓缩样本。
 
4.为了酶的免疫测定,提前用等量0.12M的碳酸盐缓冲剂(pH为9.6)来稀释原本两倍的最强浓度。
 
5.加入200微升含有100至0.1微升的o.o6M碳酸盐缓冲剂(pH9.6)来合并蛋白和polystyrene break-apart microtiter wells.
 
6.在4摄氏度环境下孵育溶液18小时后,用磷缓冲剂(0.01M磷与0.15M pH为7.2的氯化钠混合)清洗。所用的氯化钠含有0.05%的Tween-20(PBST),其放射性已被提前确认过。
 
 
酶的免疫测定
 
1.在一个酶的免疫测定中,使用不同量的、10~1微升的已被提纯的IgA, IgM, IgG1,和IgG2,作为抗原。
 
2.使用重链小白鼠血清IgA, IgM, IgG1和IgG2还有辣根过氧化物酶共轭标记兔抗鼠IgG来确认合并。
 
3.使用过氧化氢和2,2'-Azinodi-(3-ethylbenzthiazoline sulfonic acid)二铵盐,当作衬托底色。
 
4.通过用分光光度分析法414纳米来确认颜色的改变。
 
 
胃蛋白酶的消化
 
1.除了一开始的蛋白浓度是25mg/mL以外,重复Butler和Kennedy的步骤。
 
2.用50倍的pH为4.5的0.1M醋酸盐缓冲剂来过夜集中透析已提取的色谱层。此时往最终的浓度为1:50的蛋白里加入胃蛋白酶,搅拌均匀溶解,在37摄氏度里培育24小时。
 
3.运用同样的方法,血清也被胃蛋白酶消化,但不用一开始的色谱层析法。
 
4.当最后pH到达8.0的时候,停止消化。

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